Clinical Library
Litbang

2019 Litbang Diagnosis Laboratoris Leptospirosis

Terbit: 2019
Download PDF

BUKU DIAGNOSIS LABORATORIS LEPTOSPIROSIS#

Penerbit: Lembaga Penerbit Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (Balitbangkes), Kementerian Kesehatan RI Tahun: 2019 ISBN: 978-602-373-160-2 Penulis: Farida Dwi Handayani, Ristiyanto, Arum Sih Joharina, dkk.

BAB I: PENDAHULUAN#

A. Tinjauan Umum Leptospirosis#

[cite_start]Leptospirosis adalah infeksi zoonosis yang disebabkan oleh bakteri Leptospira sp. (Spirochaeta Gram-negatif) [cite: 2395-2396].

  • [cite_start]Reservoir: Tikus adalah reservoir utama; bakteri hidup di tubulus ginjal dan diekskresikan melalui urin[cite: 2398].
  • [cite_start]Epidemiologi: Merupakan re-emerging disease yang sering terjadi wabah di negara tropis seperti Indonesia [cite: 2400-2401].
  • [cite_start]Masa Inkubasi: Berkisar 2–21 hari, biasanya 7–14 hari[cite: 2404].

B. Perjalanan Klinis#

[cite_start]Penyakit ini memiliki fase bifasik (biphasic)[cite: 2404]:

  1. Fase Akut (Leptospiremia):
    • Berlangsung 4–7 hari.
    • Gejala: Demam, sakit kepala, menggigil, nyeri otot, mual, diare.
    • [cite_start]Bakteri dapat ditemukan dalam darah dan cairan serebrospinal [cite: 2408-2409].
  2. Fase Imun (Leptospiruria):
    • Ditandai dengan munculnya antibodi IgM dan ditemukannya bakteri dalam urin.
    • [cite_start]Komplikasi berat (Sindrom Weil): Ikterus, gagal ginjal, perdarahan paru, hingga kematian [cite: 2399, 2411-2412].

C. Bakteriologi Leptospira#

  • Morfologi: Berbentuk heliks/spiral, ukuran panjang 6–20 µm, tebal 0,1 µm. Ujungnya melengkung seperti mata pancing (hook). [cite_start]Tidak terlihat dengan mikroskop cahaya biasa, harus menggunakan Mikroskop Medan Gelap (Dark Field Microscope) atau pewarnaan perak (Silver Staining) [cite: 2500-2508].
  • Pertumbuhan: Aerob obligat, suhu optimal 28–30°C, pH 7–8. [cite_start]Waktu regenerasi 7–12 jam[cite: 2514, 2520, 2522].
  • [cite_start]Ketahanan: Dapat bertahan hidup di tanah lembab/basah pH netral, namun mati cepat di air payau/salinitas tinggi [cite: 2524-2525].

D. Klasifikasi#

  1. Fenotipik:
    • [cite_start]L. interrogans (Patogen): Peka terhadap 8-azaguanine, tidak tumbuh pada suhu 13°C [cite: 2561-2563].
    • L. biflexa (Non-patogen/Saprofita): Resisten terhadap 8-azaguanine, tumbuh pada suhu 13°C.
    • [cite_start]Identifikasi serovar menggunakan Cross Agglutination Absorption Test (CAAT)[cite: 2573].
  2. Genetik:
    • [cite_start]Berdasarkan homologi DNA, terdapat 22 spesies genomik[cite: 2576].
    • [cite_start]Memiliki 2 kromosom (besar dan kecil)[cite: 2580].

E. Media Kultur#

[cite_start]Leptospira membutuhkan asam lemak rantai panjang (long chain fatty acid) sebagai sumber energi, vitamin B1, dan B12[cite: 2514, 2518].

  1. Media Serum Kelinci: Contoh media Korthof, Fletcher, Stuart. [cite_start]Digunakan untuk isolasi klinis, namun tidak untuk preparasi antigen MAT [cite: 2531-2535].
  2. Media EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris): Mengandung albumin untuk mengikat asam lemak bebas yang toksik. [cite_start]Digunakan untuk perbanyakan antigen MAT [cite: 2536-2537].
  3. [cite_start]Media Bebas Protein: Menggunakan arang aktif (charcoal) sebagai detoksikan [cite: 2538-2540].
  4. [cite_start]Media Selektif: Ditambahkan 5-fluorouracil (5-FU) untuk menghambat kontaminan bakteri lain[cite: 2545].

BAB II: PROSEDUR PENGAMBILAN SAMPEL#

Skrining leptospirosis di laboratorium diawali dengan pengambilan sampel di lapangan untuk bahan uji. [cite_start]Jenis sampel yang umum diambil meliputi urin, darah, serum, dan ginjal [cite: 303-305].

A. Prosedur Pengambilan Sampel Manusia#

Pengambilan sampel darah vena dilakukan menggunakan spuit atau tabung vakum.

1. Persiapan Alat dan Bahan

  • Syringe (3cc, 5cc) atau Holder & jarum.
  • Tali pembendung (torniket).
  • Tabung Vacutainer:
    • [cite_start]EDTA: Untuk uji PCR[cite: 312].
    • [cite_start]Heparin: Untuk kultur Leptospira[cite: 313].
    • [cite_start]Non-EDTA: Untuk serum[cite: 314].

2. Langkah Kerja

  1. [cite_start]Informed Consent: Jelaskan prosedur kepada pasien dan minta tanda tangan persetujuan [cite: 319-320].
  2. Persiapan Pasien: Verifikasi identitas dan kondisi pasien (puasa/obat). [cite_start]Minta pasien meluruskan lengan dan mengepalkan tangan [cite: 325-328].
  3. [cite_start]Pemasangan Torniket: Pasang kira-kira 10 cm di atas lipat siku[cite: 328].
  4. Lokasi Vena: Pilih vena median cubital atau cephalic. [cite_start]Lakukan palpasi untuk memastikan posisi vena (teraba seperti pipa kecil elastis) [cite: 329-330].
  5. [cite_start]Desinfeksi: Bersihkan area dengan alkohol 70% dan biarkan kering[cite: 333].
  6. Pengambilan Darah:
    • [cite_start]Tusuk vena dengan posisi lubang jarum menghadap ke atas[cite: 335, 337].
    • [cite_start]Jika menggunakan tabung vakum, masukkan tabung ke dalam holder hingga darah mengalir[cite: 337].
    • [cite_start]Jika memerlukan beberapa tabung, ganti tabung setelah tabung pertama terisi[cite: 338].
  7. [cite_start]Penyelesaian: Lepas torniket, minta pasien membuka kepalan tangan, tarik jarum, dan tekan bekas suntikan dengan kapas lalu plester [cite: 339-341].

B. Prosedur Pengambilan Sampel Tikus (Reservoir)#

1. Pengambilan Darah dan Koleksi Serum

[cite_start]Alat dan Bahan: Syringe (1 ml/3 ml), tabung vacutainer non-EDTA, centrifuge, Ketamin & Xylasin [cite: 350-354].

Langkah Kerja:

  1. Anestesi: Suntikkan campuran Ketamin (70-100 mg/kgBB) dan Xylasin (2 mg/kgBB) pada paha belakang tikus. [cite_start]Tunggu 5-10 menit hingga efek bekerja [cite: 354-356].
  2. Cardiac Puncture:
    • [cite_start]Bersihkan dada tikus dengan alkohol swab[cite: 357].
    • Tusukkan jarum di bawah tulang rusuk dengan sudut 45° terhadap badan tikus. [cite_start]Arahkan ke jantung hingga darah mengalir masuk ke syringe [cite: 360-361].
  3. Koleksi Serum:
    • [cite_start]Masukkan darah ke tabung vacutainer non-EDTA (lewat dinding tabung perlahan untuk hindari hemolisis)[cite: 362].
    • [cite_start]Sentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit[cite: 363].
    • [cite_start]Ambil serum (cairan bening di atas) dan simpan dalam cryotube pada suhu 4°C sebelum pemeriksaan [cite: 364-366].

2. Pengambilan Ginjal Tikus

Ginjal diambil untuk mendeteksi koloni Leptospira yang menetap di tubulus ginjal reservoir.

[cite_start]Alat dan Bahan: Gunting bedah, pinset, vial kaca ulir, alkohol 70% [cite: 375-381].

Langkah Kerja:

  1. [cite_start]Letakkan tikus yang sudah dianestesi pada nampan bersih dan desinfeksi area perut [cite: 383-384].
  2. Pembedahan:
    • Jepit kulit perut bawah, gunting menembus kulit dan otot perut.
    • [cite_start]Buat potongan lurus dari perut ke arah dada [cite: 385-386].
    • [cite_start]Tarik kulit dan otot di atas diafragma untuk mengekspos rongga perut sepenuhnya[cite: 387].
  3. Koleksi Organ:
    • Ambil kedua ginjal.
    • [cite_start]Masukkan ke dalam vial kaca berisi alkohol 70%[cite: 388].
    • [cite_start]Simpan pada suhu ruang sebelum pemeriksaan lebih lanjut[cite: 391].

BAB III: PROSEDUR PEMERIKSAAN#

[cite_start]Pemeriksaan laboratorium untuk leptospirosis dibagi menjadi pemeriksaan serologis dan molekuler [cite: 403-407].

A. Pemeriksaan Serologis: Microscopic Agglutination Test (MAT)#

[cite_start]MAT merupakan standar baku emas (gold standard) diagnosis leptospirosis karena spesifisitasnya yang tinggi[cite: 417].

1. Prinsip Kerja

  • Berdasarkan reaksi antigen-antibodi.
  • Serum penderita direaksikan dengan suspensi panel serovar Leptospira hidup.
  • [cite_start]Aglutinasi (penggumpalan) dilihat di bawah mikroskop medan gelap (Dark Field Microscope) [cite: 405-406].

2. Alat dan Bahan

  • Plate MAT, Mikroskop medan gelap, Inkubator, Micro shaker.
  • [cite_start]Serum pasien/hewan, Kultur Leptospira (panel antigen), PBS 1x [cite: 447-456].

3. Prosedur Pemeriksaan

  1. [cite_start]Pengenceran: Lakukan serial dilusi serum mulai dari pengenceran 1:20 dalam PBS [cite: 458-460].
  2. [cite_start]Penambahan Antigen: Tambahkan 50 µl kultur Leptospira hidup ke dalam sumuran[cite: 461].
  3. [cite_start]Inkubasi: Campur dengan shaker dan inkubasi selama 2–4 jam pada suhu 37°C [cite: 463-464].
  4. Pembacaan: Periksa di bawah mikroskop medan gelap. [cite_start]Positif jika terjadi aglutinasi dengan titer tertentu (misal cut-off 1:20 untuk surveilans tikus) [cite: 465-466].

B. Pemeriksaan Molekuler#

Metode ini mendeteksi DNA Leptospira menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

1. Ekstraksi DNA

[cite_start]Proses mengeluarkan DNA dari sampel (urin, darah, atau jaringan ginjal) melalui tahapan lisis, pengikatan (binding), pencucian (washing), dan elusi [cite: 474-476].

  • [cite_start]Sampel Urin: Sentrifugasi kecepatan tinggi, cuci pelet dengan PBS, lisis dengan Proteinase K, lalu purifikasi menggunakan spin column [cite: 494-512].
  • [cite_start]Sampel Darah/Serum: Lisis dengan Buffer AL dan Proteinase K pada suhu 56°C, ikatkan ke kolom silika, cuci dengan etanol/wash buffer, dan elusi [cite: 523-541].
  • [cite_start]Sampel Ginjal: Gerus bagian korteks ginjal, lisis semalaman pada suhu 55°C, lalu ekstraksi sesuai protokol [cite: 552-560].

2. PCR Konvensional

[cite_start]Mendeteksi gen spesifik (seperti LipL32 atau secY) dan divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarose [cite: 590, 595-598].

  • Primer: Menggunakan primer forward dan reverse spesifik.
  • Siklus Thermal:
    • Predenaturasi: 95°C (5 menit).
    • Denaturasi: 94°C (30 detik).
    • Annealing: 58°C (30 detik).
    • Ekstensi: 72°C (1 menit).
    • [cite_start]Siklus diulang 35x, diakhiri ekstensi akhir 7 menit[cite: 619].
  • [cite_start]Visualisasi: Elektroforesis pada gel agarose 1,5% - 2% dengan pewarna DNA (Ethidium Bromide/Sybr Safe)[cite: 621, 641].

3. Real Time PCR (qPCR)

[cite_start]Metode yang lebih sensitif dan cepat, menggunakan pewarna fluoresens (seperti EvaGreen) untuk memantau amplifikasi secara real-time[cite: 689].

  • [cite_start]Target: Gen secY atau target spesifik lain[cite: 690].
  • [cite_start]Protokol Suhu: Denaturasi 95°C, Annealing 60°C (40 siklus), dilanjutkan dengan analisis Melt Curve (65-95°C) untuk memastikan spesifisitas produk[cite: 713].

4. Sequencing DNA

[cite_start]Dilakukan untuk menentukan spesies dan serovar secara genotipik dengan membaca urutan basa DNA[cite: 788].

  • Tahapan:
    1. [cite_start]Purifikasi produk PCR (menghilangkan sisa primer/dNTP)[cite: 792].
    2. Cycle Sequencing menggunakan BigDye terminator.
    3. Purifikasi produk sekuensing (presipitasi etanol/EDTA).
    4. [cite_start]Elektroforesis Kapiler (Capillary Electrophoresis) pada mesin sekuenser[cite: 816].
  • [cite_start]Analisis: Hasil sekuens dibandingkan dengan database GenBank menggunakan software bioinformatika (misal BioEdit) untuk identifikasi[cite: 819].